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PCR反應循環參數溫度與時間設置
日期：2025-06-16 00:31
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摘要：
溫度循環參數：
1．變性溫度與時間
PCR反應中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結合。這種結合是PCR擴增的基礎。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應中第1個循環變性重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。
2．復性溫度與時間
變性溫度是PCR反應成敗的關鍵，復性溫度決定...
溫度循環參數：
1．變性溫度與時間
PCR反應中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結合。這種結合是PCR擴增的基礎。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應中第1個循環變性重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。
2．復性溫度與時間
變性溫度是PCR反應成敗的關鍵，復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好，但是容易出現引物與靶DNA的錯配，增加非特異性結合，溫度太高不利于復性，大多數PCR反應的復性溫度在55℃左右。確定了復性溫度后，復性時間并不是關鍵因素。但復性時間太長會增加非特異的復性。
3．延伸溫度與時間
引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產物的特異性，也會影響其產量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質。72℃延伸1min對于長達2kb的擴增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對很低濃度底物的擴增，延伸時間要長些。
4．循環數：
循環數決定著擴增的產量。在其它參數都已優化條件下，適循環數取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環次數。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環次數、以便達到有效的擴增量。