實驗開始前，各試劑和樣本均應平衡至室溫；樣本復融后需再次離心，取上清檢測；試劑或樣本配制時，需充分混勻并盡量避免起泡；標曲和樣本建議做復孔檢測。

1. 加樣：將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL(若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。給酶標板覆膜，37℃孵育90分鐘。提示：加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產生氣泡。加樣時間宜控制在10分鐘內。

2. 生物素化抗體/抗原：棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中立即加入生物素化抗體/抗原工作液100 μL，混勻，酶標板加上覆膜， 37℃孵育1小時。

3. 洗滌：甩盡孔內液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。重復此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機。每一步洗滌充分是實驗的根本。

4. HRP酶結合物：每孔加酶結合物工作液100 μL，混勻，加上覆膜，37℃孵育30分鐘。

5. 洗滌：棄去孔內液體，洗板5次，方法同步驟3。

6. 底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據實際顯色 情況酌情縮短或延長孵育時間，但不可超過30分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止。

7. 終止：每孔加終止液50 μL，終止反應。提示：終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。

8. 讀值：立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀預熱，設置好檢測程序。

9. 實驗完畢后，將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存至保質期。