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PCR反應引物設計基礎
日期：2025-06-15 01:16
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摘要：
PCR反應引物設計基礎:（99%的問題可以解決）
1.引物長度：教科書要求15-30bp，常用為20bp左右。實際情況zui好是18-24bp，以保證特異性，不是越長越好，太長的引物同樣會降低特異性，并且降低產量 。
2.引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGCzui好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。5'端和中間序列要多GC，以增加穩定性，避免3'端GC rich， zui后3個...
PCR反應引物設計基礎:（99%的問題可以解決）
1.引物長度：教科書要求15-30bp，常用為20bp左右。實際情況zui好是18-24bp，以保證特異性，不是越長越好，太長的引物同樣會降低特異性，并且降低產量 。
2.引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGCzui好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。5'端和中間序列要多GC，以增加穩定性，避免3'端GC rich， zui后3個堿基不要有GC，或者zui后5個有3個不要是GC。
4.避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
5.引物3’端的堿基，特別是zui末及倒數第2個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
6.引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列zui好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
7.引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
8.學會使用軟件：PP5，Oligo6，DNAstar，Vector NTI，primer3（這個在線設計zui好用）。
以上內容，至少可以解決99%的引物設計問題。